万历二十一年春，西南边陲的平静被彻底打破。播州世袭土司杨应龙，因与朝廷矛盾激化，首次与明军兵戎相见。朝廷急命文臣王继光、武将刘承嗣与郭成，分三路大军进剿。熟谙地形的杨应龙巧施“声东击西”之计，表面佯装约降，暗中却集结精兵据守险关，猛然冲杀。此役结果，一路明军遭遇惨败，死伤过半，其余部队亦无功而返，朝廷的首次征剿以失利告终。
杨应龙大败官军，震动朝野。主帅王继光被革职查办，朝廷的应对策略也从急剿转为缓图，新任官员更倾向于招抚。面对朝廷态度的转变，杨应龙虽表面认罪服软，立誓保境安民，内心却已埋下不满的种子。朝廷最终决定革去其土司职务，并罚其“输四万金助采木”。这一处罚令杨应龙大为不满，加之其被押作人质的次子杨可栋在京城意外身亡，使他悲痛欲绝，与朝廷的裂痕彻底无法弥合。他不仅拒缴罚金，更公然“拥兵驱千余僧”为子招魂，反意已昭然若揭。
万历二十四年，积怨已深的杨应龙终于公开举起反旗。此时，明朝正将主要精力集中于遥远的朝鲜战场（即万历三大征中的朝鲜之役），西南防务空虚。杨应龙趁机大肆扩张，不断出兵袭扰川、黔、湖广交界地区，势力迅速膨胀。至万历二十七年，战火全面点燃。贵州巡抚江东之率先发兵三千征讨，却在飞练堡遭播军诱敌深入，全军覆没。江东之被罢免，朝廷至此方知事态严重性。
同年六月，冲突因綦江参将房嘉宠滥杀播民而急剧升级。杨应龙以此为号，倾巢而出，率八万大军猛攻綦江城。城破后，播军进行了残酷的屠戮，五千官兵罹难，尸体被抛入江中，以致“江水为赤”。此战震惊全国，杨应龙随后退守，并立碑划界，宣称更广大区域为播州故土，同时联合当地苗部，构筑起庞大的防御同盟。消息传至京师，明神宗勃然大怒，决心彻底解决播州问题。
万历二十七年十月，朝廷启用能臣李化龙，总督四川、湖广、贵州军务，调集浙、闽、滇、粤等省精锐，筹备大规模平叛。杨应龙则加紧修缮海龙屯等天险要塞，企图凭险固守。万历二十八年正月，明军完成集结，在李化龙指挥下，分八路大军，总计二十四万兵力，发动了空前规模的围剿。其中，刘綎部骁勇善战，于三月二十九日一举攻克天险娄山关，打开了通往播州腹地的门户。杨应龙被迫率残部退守最后的堡垒——海龙屯。
海龙屯地势险绝，易守难攻。自五月起，明军将其重重包围，轮番猛攻。播军凭滚木礌石苦苦支撑，主将杨珠亦战死。战事持续四十余日，阴雨连绵，战斗异常艰苦。期间，李化龙甚至因父丧而“穿戴丧服”继续指挥，可见朝廷决心之坚。六月初四，天气放晴，明军发动总攻。次日，官军敢死队攀岩而上，突破土城。六月初六凌晨，明军最终攻破核心关隘。杨应龙见大势已去，与二妾闭户自缢，并试图举火自焚。官军及时扑入，将其尸体拖出火海，其子杨朝栋等百余人被俘。历时百余日的播州之役，以杨氏政权的彻底覆灭而告终。
这场战役深刻影响了明朝的西南边疆治理。战后，朝廷废除播州宣慰司，实行“改土归流”，将其地分设遵义、平越二府，分别划归四川与贵州管辖，大大加强了中央政府对西南地区的直接控制。此役不仅消耗了明朝大量国力，也与同时期的宁夏之役、朝鲜之役并称为“万历三大征”，成为明王朝由盛转衰过程中的重要标志性事件之一。
